2017年6月28日，國(guó)際學(xué)術(shù)權(quán)威刊物自然出版集團(tuán)旗下子刊《Nature Chemical Biology》雜志在線發(fā)表了清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院李海濤研究組、美國(guó)得克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心Mark Bedford教授研究組與意大利薩萊諾大學(xué)Gianluca Sbardella教授研究組合作的題為《應(yīng)用蛋白陣列技術(shù)研發(fā)Spindlin1小分子抑制劑》(Developing spindlin1 small-molecule inhibitors by using protein microarrays)的合作研究論文，通過(guò)構(gòu)建組蛋白閱讀器結(jié)構(gòu)域蛋白芯片，并結(jié)合基于結(jié)構(gòu)的構(gòu)效關(guān)系演化，開(kāi)發(fā)出專門(mén)針對(duì)Spindlin1的活性小分子抑制劑，為今后模式結(jié)構(gòu)域(modular domain)靶向的藥物篩選與開(kāi)發(fā)提供了一種新技術(shù)模式。博士后蘇曉楠為論文并列第一作者，李海濤教授與Mark Bedford教授和Gianluca Sbardella教授為共同作者。

組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控基本機(jī)制之一，被認(rèn)為構(gòu)成一類“組蛋白密碼”，調(diào)控著遺傳信息在染色質(zhì)層面的組織與解讀。組蛋白修飾的一種作用模式是招募一類被稱作“閱讀器”(reader)的效應(yīng)因子，通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)開(kāi)關(guān)狀態(tài)而調(diào)控基因活度和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響細(xì)胞分裂、增殖、分化和凋亡等眾多細(xì)胞進(jìn)程。值得注意的是，在癌癥等眾多疾病中存在組蛋白修飾及其“閱讀器”識(shí)別紊亂調(diào)控的現(xiàn)象。近年來(lái)，組蛋白“閱讀器”逐漸成為藥物研發(fā)中的一類重要靶點(diǎn)，一個(gè)著名的例子是BRD4的Bromo結(jié)構(gòu)域。能夠識(shí)別組蛋白修飾的“閱讀器”結(jié)構(gòu)域種類繁多，如PHD鋅指、Tudor、Chromo、PWWP、MBT、BAH、Bromo、YEATS等，他們能夠以修飾位點(diǎn)和類型特異的方式來(lái)識(shí)別并破譯“組蛋白密碼”。因此，尋找針對(duì)組蛋白閱讀器的特異抑制劑，是當(dāng)前表觀遺傳領(lǐng)域藥物研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

組蛋白甲基化是一類重要的組蛋白修飾，主要發(fā)生在賴氨酸和精氨酸等殘基上，通?？梢员弧伴喿x器”中的芳香籠口袋(aromatic cage)識(shí)別并解讀。鑒于芳香籠口袋的結(jié)構(gòu)相似性，開(kāi)發(fā)特異靶向不同甲基化“閱讀器”的小分子抑制劑成為一個(gè)領(lǐng)域挑戰(zhàn)。本研究首先通過(guò)構(gòu)建組蛋白賴氨酸甲基化“閱讀器”結(jié)構(gòu)域蛋白陣列芯片，其中涉及隸屬Tudor、Chromo、PHD、BAH、MBT、PWWP、ANK、AGENET、HEAT等類型的蛋白結(jié)構(gòu)域共98個(gè);隨后，采用一種基于熒光的檢測(cè)手段對(duì)生物素標(biāo)記的小分子抑制劑進(jìn)行針對(duì)該98個(gè)潛在“閱讀器”靶點(diǎn)的“l(fā)ab-on-chip”高通量評(píng)估和篩選。利用該項(xiàng)技術(shù)研究組成功篩選出EML405小分子的潛在靶點(diǎn)Spindlin1、PHF20、L3MBTL1、53BP1等，并在體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。

李海濤研究組曾于2014年在《基因與發(fā)育》發(fā)文報(bào)導(dǎo)Spindlin1是一類新型組蛋白“閱讀器”，其含有三個(gè)串聯(lián)重復(fù)類Tudor結(jié)構(gòu)域，通過(guò)前兩個(gè)類Tudor結(jié)構(gòu)域特異性識(shí)別組蛋白“賴氨酸-精氨酸”甲基化組合，H3“K4me3-R8me2a”，進(jìn)而激活Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄，是結(jié)腸癌等諸多癌癥發(fā)生中的促癌因子。以Spindlin1為突破點(diǎn)，李海濤研究組通過(guò)X射線晶體衍射技術(shù)揭示了EML405小分子結(jié)合Spindlin1的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)EML405小分子的兩臂恰巧結(jié)合在Spindlin1的前兩個(gè)功能性芳香族口袋中，阻斷其對(duì)組蛋白H3“K4me3-R8me2a”的識(shí)別。在Spindlin1-EML405的復(fù)合物結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，研究人員進(jìn)一步優(yōu)化出EML405小分子的衍生體EML631、EML632、EML633，并系統(tǒng)的開(kāi)展了EML631-633與Spindlin1、PHF20、L3MBTL1、L3MBTL3、53BP1靶點(diǎn)的定性、定量結(jié)合分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EML衍生小分子能夠大大提高Spindlin1靶點(diǎn)的識(shí)別特異性，其中EML631以4微摩爾親和力結(jié)合Spindlin1，而對(duì)PHF20、L3MBTL1、L3MBTL3、53BP1靶點(diǎn)的結(jié)合能力降到亞毫摩爾級(jí)別。Spindlin1-EML631的晶體結(jié)構(gòu)解析進(jìn)一步揭示了EML631對(duì)Spindlin1高度選擇性的分子機(jī)制。同時(shí)，RNA-seq和ChIP-qPCR結(jié)果顯示，EML631能夠有效抑制Spindlin1激活基因轉(zhuǎn)錄的活性。因此，本工作以組蛋白“閱讀器”蛋白芯片為切入點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出針對(duì)Spindlin1靶點(diǎn)的特異性小分子抑制劑，這為今后以模式結(jié)構(gòu)域?yàn)榘悬c(diǎn)的特異小分子篩選開(kāi)發(fā)建立了一個(gè)新型研發(fā)模式。

圖 利用蛋白陣列篩選小分子抑制劑

原文鏈接：

Developing Spindlin1 small-molecule inhibitors by using protein microarrays

原文摘要：

The discovery of inhibitors of methyl- and acetyl-binding domains has provided evidence for the 'druggability' of epigenetic effector molecules. The small-molecule probe UNC1215 prevents methyl-dependent protein-protein interactions by engaging the aromatic cage of MBT domains and, with lower affinity, Tudor domains. Using a library of tagged UNC1215 analogs, we screened a protein-domain microarray of human methyllysine effector molecules to rapidly detect compounds with new binding profiles with either increased or decreased specificity. Using this approach, we identified a compound (EML405) that acquired a novel interaction with the Tudor-domain-containing protein Spindlin1 (SPIN1). Structural studies facilitated the rational synthesis of SPIN1 inhibitors with increased selectivity (EML631–633), which engage SPIN1 in cells, block its ability to 'read' H3K4me3 marks and inhibit its transcriptional-coactivator activity. Protein microarrays can thus be used as a platform to 'target-hop' and identify small molecules that bind and compete with domain-motif interactions.